一、疫苗研發(fā)方案

（Ⅰ）小鼠細(xì)胞培養(yǎng)疫苗實(shí)驗(yàn)階段

細(xì)胞培養(yǎng)疫苗有細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗和細(xì)胞培養(yǎng)活疫苗兩類，前者多以強(qiáng)毒毒株培養(yǎng)增殖制造，后者則用弱毒毒株增殖生產(chǎn)，兩者的制造程序既有相同之處，又有區(qū)別。由于病毒不同與疫苗性質(zhì)不同，所采用的細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)方法也有所不同。

（一）種毒與毒種繼代

用于制苗用的種毒應(yīng)經(jīng)毒力、最小免疫量、安全性、無菌檢定合格，通常為凍干品，由國家指定的苗毒種保藏部門檢定分發(fā)。

領(lǐng)取的種毒應(yīng)按規(guī)定在細(xì)胞繼代培養(yǎng)適應(yīng)后用作毒種，制苗用毒種應(yīng)按規(guī)定控制在一定代數(shù)以內(nèi)，或?yàn)闈穸径痉N，或?yàn)閮龈啥痉N。

（二）細(xì)胞制備

制造疫苗用的細(xì)胞大體為原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞兩類，根據(jù)病毒種類、疫苗性質(zhì)與工藝流程選擇不同的細(xì)胞。 選擇的依據(jù)包括：病毒的適應(yīng)性高、毒價(jià)高、細(xì)胞來源方便、制備簡單、生命力強(qiáng)。 如脊髓灰質(zhì)炎活疫苗選擇vero細(xì)胞；狂犬病弱毒細(xì)胞適應(yīng)疫苗采取BHK21細(xì)胞增殖病毒豬瘟兔化弱毒牛睪丸細(xì)胞疫苗采用犢牛睪丸原代細(xì)胞等。 培養(yǎng)細(xì)胞和增殖病毒用的營養(yǎng)液又稱培養(yǎng)液，通常分為細(xì)胞培養(yǎng)用的生長液和病毒增殖用的維持液，兩者不同的之處通常只是生長液內(nèi)含有5%-10%的血清；維持液血清濃度為2%-5%。 不同細(xì)胞所需的營養(yǎng)成分和生長條件不盡相同。 目前常用的細(xì)胞培養(yǎng)方法為靜止培養(yǎng)和轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)，至于微載體培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)在我國尚處于試驗(yàn)之中。

（四）接毒與收獲

病毒接種培養(yǎng)有同步與異步之分，前者在細(xì)胞分裝同時(shí)或不久接種毒種，進(jìn)行培養(yǎng)，如貓、犬傳染性腸炎疫苗(細(xì)小病毒)；后者在細(xì)胞形成單層后接種毒種，如流行性乙型腦炎細(xì)胞培養(yǎng)疫苗。通常在細(xì)胞形成單層后傾去培養(yǎng)液，按1%-2%量接種毒種，經(jīng)吸附后加入維持液繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，待出現(xiàn)70%-85%以上細(xì)胞病變時(shí)即可收獲。

病毒培養(yǎng)液收獲時(shí)間和方法依疫苗性質(zhì)而定，可將培養(yǎng)瓶凍融數(shù)次后收集；或加入EDTA-胰蛋白酶液消化分散收??；或在病毒增殖培養(yǎng)過程中可收獲5-7次毒液，細(xì)胞毒液經(jīng)無菌檢驗(yàn)、毒價(jià)測定合格后供配苗用。病毒在易感動物體內(nèi)可大量增殖，但在各器官組織、部位中增殖病毒的量卻有很大的差異，利用病毒增殖迅速、含毒量高的組織制造的疫苗稱為組織疫苗(tissue vaccine)。

動物組織疫苗包括動物組織滅活疫苗和動物組織弱毒活苗兩類，前者多數(shù)由強(qiáng)毒株制造，如豬瘟結(jié)晶紫疫苗、狂犬病羊腦組織疫苗；后者均以弱毒株生產(chǎn)，如豬瘟兔化弱毒乳兔組織疫苗、牛瘟兔化弱毒組織疫苗等。

（一）動物選擇

動物質(zhì)量直接影響到組織疫苗的質(zhì)量，特別是對疫苗的安全性和效力有著決定性的作用，動物必須符合下列標(biāo)準(zhǔn)：

(1)應(yīng)該是清潔級(二級)以上的等級實(shí)驗(yàn)動物，即無規(guī)定的人獸共患性病原體動物；

(2)應(yīng)是對所接種病毒易感性高的動物，即在品種、年齡和體重方面合乎要求的實(shí)驗(yàn)動物。

（二）種毒與接種

種毒既可用抗原性優(yōu)良、致死力強(qiáng)的自然毒株臟器組織毒或強(qiáng)毒株增殖培養(yǎng)物，也可用弱毒株組織毒種。無論何種種毒都須經(jīng)純粹、抗原性和免疫原性檢查合格后使用。

接種途徑依病毒性質(zhì)和目的而異，例如豬瘟結(jié)晶疫苗，采取豬肌肉注射血液毒種；牛瘟兔化弱毒疫苗，以兔耳靜脈注射脾淋毒種；狂犬病疫苗，用兔腦毒種接種綿羊腦內(nèi)途徑感染。

幾種動物常用的接種途徑如下：

1. 腦內(nèi)注射：顱前后中線5mm平行線與瞳孔橫線交叉處。

2. 靜脈注射：家兔由耳靜脈注入；雞自翅下肢靜脈注入。

3. 肌肉注射：選擇腿部、胸部、臀部等肌肉豐滿處注射。

4. 皮下注射：家兔和豚鼠可選擇在腹部或后腿內(nèi)注射。

5. 腹腔注射：家兔與豚鼠可選腹股溝處刺入腹腔。

（三）觀察與收獲

動物在接種感染后應(yīng)每天觀察和檢查規(guī)定的各項(xiàng)指標(biāo)，指標(biāo)或項(xiàng)目因不同病毒而異。常規(guī)觀察、檢查的項(xiàng)目如食欲、精神和活動狀態(tài)、體溫、糞便、尿和血液變化等。

根據(jù)觀察的征象和檢查的結(jié)果選出符合要求的發(fā)病動物按規(guī)定方式剖殺，采取收集含毒量高的器官組織。如豬瘟結(jié)晶紫疫苗采取發(fā)病豬的血液制備；兔出血癥組織滅活疫苗采集病兔肝臟生產(chǎn)；狂犬病疫苗利用發(fā)病羊的羊腦組織制造。

（四）制 苗

1．組織滅活疫苗

采取收獲的組織經(jīng)無菌檢驗(yàn)及毒價(jià)測定合格后，按規(guī)定比例加入平衡液和滅活劑（甲醛、酚、結(jié)晶紫等）制成勻漿，然后按不同病毒的滅活溫度、時(shí)間進(jìn)行滅活。如狂犬病疫苗配制按腦組織1:4加入含有甘油及1%酚蒸餾水，于36?0.5C滅活7天制成；豬瘟結(jié)晶紫疫苗配制，按血毒4份，結(jié)晶紫甘油溶液1份混合，于37?C~38?C滅活6~8天。

2. 弱毒組織疫苗

在無菌操作下剔除臟器上的脂肪與結(jié)締組織等，稱重后剪碎，加入適最保護(hù)劑制成勻漿，然后濾過扣除殘?jiān)?，再按濾液中的實(shí)際組織量計(jì)算稀釋倍數(shù)，加入余量保護(hù)劑和青鏈霉素500~1000U(?g/ml)，充分搖勻后置0~4?C冷暗處處理一定時(shí)間后作無菌檢驗(yàn)與毒價(jià)測定。合格者進(jìn)行分裝，冷凍真空干燥制成凍干疫苗。

（五）疫苗檢定，測定有效性和安全性

二、臨床前研究、臨床研究

（一）臨床前及臨床研究

新藥開發(fā)階段如下：

臨床前試驗(yàn)：由制藥公司進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)室和動物研究，以觀察化合物針對目標(biāo)疾病的生物活性，同時(shí)對化合物進(jìn)行安全性評估。這些試驗(yàn)大概需要3.5 年的時(shí)間。

研發(fā)中新藥申請（Investigational New Application, IND）：在臨床前試驗(yàn)完成后，公司要向FDA 提請一份IND，之后才能開始進(jìn)行藥物的人體試驗(yàn)。如果30 天內(nèi)FDA 沒有發(fā)出不予批準(zhǔn)的申明，此IND 即為有效。提出的IND 需包括以下內(nèi)容：先期的試驗(yàn)結(jié)果，后續(xù)研究的方式、地點(diǎn)以及研究對象；化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)；在體內(nèi)的作用機(jī)制；動物研究中發(fā)現(xiàn)的任何毒副作用以及化合物的生產(chǎn)工藝。另外，IND 必須得到制度審核部門（the Institutional Review Board）的審核和批準(zhǔn)。同時(shí)，后續(xù)的臨床研究需至少每年向FDA 提交一份進(jìn)展報(bào)告并得到準(zhǔn)許。

臨床試驗(yàn)，Ⅰ期：此階段大概需要1 年時(shí)間，由20～80 例正常健康志愿者參加。這些試驗(yàn)研究了藥物的安全性方面，包括安全劑量范圍。此階段的研究同時(shí)確定了藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄、以及藥物的作用持續(xù)時(shí)間等項(xiàng)目。

臨床試驗(yàn)，Ⅱ期：此階段需要約100 到300 名志愿患者參與進(jìn)行一些控制研究，以評價(jià)藥物的療效。這個(gè)階段大約需要2 年時(shí)間。

臨床研究，Ⅲ期：此階段持續(xù)約3 年時(shí)間，通常需要診所和醫(yī)院的1000～300 名患者參與。醫(yī)師通過對病患的監(jiān)測以確定療效和不良反應(yīng)。