一、疫苗研發(fā)方案
(Ⅰ)小鼠細(xì)胞培養(yǎng)疫苗實(shí)驗(yàn)階段
細(xì)胞培養(yǎng)疫苗有細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗和細(xì)胞培養(yǎng)活疫苗兩類,前者多以強(qiáng)毒毒株培養(yǎng)增殖制造,后者則用弱毒毒株增殖生產(chǎn),兩者的制造程序既有相同之處,又有區(qū)別。由于病毒不同與疫苗性質(zhì)不同,所采用的細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)方法也有所不同。
(一)種毒與毒種繼代
用于制苗用的種毒應(yīng)經(jīng)毒力、最小免疫量、安全性、無菌檢定合格,通常為凍干品,由國家指定的苗毒種保藏部門檢定分發(fā)。
領(lǐng)取的種毒應(yīng)按規(guī)定在細(xì)胞繼代培養(yǎng)適應(yīng)后用作毒種,制苗用毒種應(yīng)按規(guī)定控制在一定代數(shù)以內(nèi),或?yàn)闈穸径痉N,或?yàn)閮龈啥痉N。
(二)細(xì)胞制備
制造疫苗用的細(xì)胞大體為原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞兩類,根據(jù)病毒種類、疫苗性質(zhì)與工藝流程選擇不同的細(xì)胞。 選擇的依據(jù)包括:病毒的適應(yīng)性高、毒價(jià)高、細(xì)胞來源方便、制備簡單、生命力強(qiáng)。 如脊髓灰質(zhì)炎活疫苗選擇vero細(xì)胞;狂犬病弱毒細(xì)胞適應(yīng)疫苗采取BHK21細(xì)胞增殖病毒豬瘟兔化弱毒牛睪丸細(xì)胞疫苗采用犢牛睪丸原代細(xì)胞等。 培養(yǎng)細(xì)胞和增殖病毒用的營養(yǎng)液又稱培養(yǎng)液,通常分為細(xì)胞培養(yǎng)用的生長液和病毒增殖用的維持液,兩者不同的之處通常只是生長液內(nèi)含有5%-10%的血清;維持液血清濃度為2%-5%。 不同細(xì)胞所需的營養(yǎng)成分和生長條件不盡相同。 目前常用的細(xì)胞培養(yǎng)方法為靜止培養(yǎng)和轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng),至于微載體培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)在我國尚處于試驗(yàn)之中。
(四)接毒與收獲
病毒接種培養(yǎng)有同步與異步之分,前者在細(xì)胞分裝同時(shí)或不久接種毒種,進(jìn)行培養(yǎng),如貓、犬傳染性腸炎疫苗(細(xì)小病毒);后者在細(xì)胞形成單層后接種毒種,如流行性乙型腦炎細(xì)胞培養(yǎng)疫苗。通常在細(xì)胞形成單層后傾去培養(yǎng)液,按1%-2%量接種毒種,經(jīng)吸附后加入維持液繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng),待出現(xiàn)70%-85%以上細(xì)胞病變時(shí)即可收獲。
病毒培養(yǎng)液收獲時(shí)間和方法依疫苗性質(zhì)而定,可將培養(yǎng)瓶凍融數(shù)次后收集;或加入EDTA-胰蛋白酶液消化分散收??;或在病毒增殖培養(yǎng)過程中可收獲5-7次毒液,細(xì)胞毒液經(jīng)無菌檢驗(yàn)、毒價(jià)測定合格后供配苗用。病毒在易感動物體內(nèi)可大量增殖,但在各器官組織、部位中增殖病毒的量卻有很大的差異,利用病毒增殖迅速、含毒量高的組織制造的疫苗稱為組織疫苗(tissue vaccine)。
動物組織疫苗包括動物組織滅活疫苗和動物組織弱毒活苗兩類,前者多數(shù)由強(qiáng)毒株制造,如豬瘟結(jié)晶紫疫苗、狂犬病羊腦組織疫苗;后者均以弱毒株生產(chǎn),如豬瘟兔化弱毒乳兔組織疫苗、牛瘟兔化弱毒組織疫苗等。
(一)動物選擇
動物質(zhì)量直接影響到組織疫苗的質(zhì)量,特別是對疫苗的安全性和效力有著決定性的作用,動物必須符合下列標(biāo)準(zhǔn):
(1)應(yīng)該是清潔級(二級)以上的等級實(shí)驗(yàn)動物,即無規(guī)定的人獸共患性病原體動物;
(2)應(yīng)是對所接種病毒易感性高的動物,即在品種、年齡和體重方面合乎要求的實(shí)驗(yàn)動物。
(二)種毒與接種
種毒既可用抗原性優(yōu)良、致死力強(qiáng)的自然毒株臟器組織毒或強(qiáng)毒株增殖培養(yǎng)物,也可用弱毒株組織毒種。無論何種種毒都須經(jīng)純粹、抗原性和免疫原性檢查合格后使用。
接種途徑依病毒性質(zhì)和目的而異,例如豬瘟結(jié)晶疫苗,采取豬肌肉注射血液毒種;牛瘟兔化弱毒疫苗,以兔耳靜脈注射脾淋毒種;狂犬病疫苗,用兔腦毒種接種綿羊腦內(nèi)途徑感染。
幾種動物常用的接種途徑如下:
1. 腦內(nèi)注射:顱前后中線5mm平行線與瞳孔橫線交叉處。
2. 靜脈注射:家兔由耳靜脈注入;雞自翅下肢靜脈注入。
3. 肌肉注射:選擇腿部、胸部、臀部等肌肉豐滿處注射。
4. 皮下注射:家兔和豚鼠可選擇在腹部或后腿內(nèi)注射。
5. 腹腔注射:家兔與豚鼠可選腹股溝處刺入腹腔。
(三)觀察與收獲
動物在接種感染后應(yīng)每天觀察和檢查規(guī)定的各項(xiàng)指標(biāo),指標(biāo)或項(xiàng)目因不同病毒而異。常規(guī)觀察、檢查的項(xiàng)目如食欲、精神和活動狀態(tài)、體溫、糞便、尿和血液變化等。
根據(jù)觀察的征象和檢查的結(jié)果選出符合要求的發(fā)病動物按規(guī)定方式剖殺,采取收集含毒量高的器官組織。如豬瘟結(jié)晶紫疫苗采取發(fā)病豬的血液制備;兔出血癥組織滅活疫苗采集病兔肝臟生產(chǎn);狂犬病疫苗利用發(fā)病羊的羊腦組織制造。
(四)制 苗
1.組織滅活疫苗
采取收獲的組織經(jīng)無菌檢驗(yàn)及毒價(jià)測定合格后,按規(guī)定比例加入平衡液和滅活劑(甲醛、酚、結(jié)晶紫等)制成勻漿,然后按不同病毒的滅活溫度、時(shí)間進(jìn)行滅活。如狂犬病疫苗配制按腦組織1:4加入含有甘油及1%酚蒸餾水,于36?0.5C滅活7天制成;豬瘟結(jié)晶紫疫苗配制,按血毒4份,結(jié)晶紫甘油溶液1份混合,于37?C~38?C滅活6~8天。
2. 弱毒組織疫苗
在無菌操作下剔除臟器上的脂肪與結(jié)締組織等,稱重后剪碎,加入適最保護(hù)劑制成勻漿,然后濾過扣除殘?jiān)?,再按濾液中的實(shí)際組織量計(jì)算稀釋倍數(shù),加入余量保護(hù)劑和青鏈霉素500~1000U(?g/ml),充分搖勻后置0~4?C冷暗處處理一定時(shí)間后作無菌檢驗(yàn)與毒價(jià)測定。合格者進(jìn)行分裝,冷凍真空干燥制成凍干疫苗。
(五)疫苗檢定,測定有效性和安全性
二、臨床前研究、臨床研究
(一)臨床前及臨床研究
新藥開發(fā)階段如下:
臨床前試驗(yàn):由制藥公司進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)室和動物研究,以觀察化合物針對目標(biāo)疾病的生物活性,同時(shí)對化合物進(jìn)行安全性評估。這些試驗(yàn)大概需要3.5 年的時(shí)間。
研發(fā)中新藥申請(Investigational New Application, IND):在臨床前試驗(yàn)完成后,公司要向FDA 提請一份IND,之后才能開始進(jìn)行藥物的人體試驗(yàn)。如果30 天內(nèi)FDA 沒有發(fā)出不予批準(zhǔn)的申明,此IND 即為有效。提出的IND 需包括以下內(nèi)容:先期的試驗(yàn)結(jié)果,后續(xù)研究的方式、地點(diǎn)以及研究對象;化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu);在體內(nèi)的作用機(jī)制;動物研究中發(fā)現(xiàn)的任何毒副作用以及化合物的生產(chǎn)工藝。另外,IND 必須得到制度審核部門(the Institutional Review Board)的審核和批準(zhǔn)。同時(shí),后續(xù)的臨床研究需至少每年向FDA 提交一份進(jìn)展報(bào)告并得到準(zhǔn)許。
臨床試驗(yàn),Ⅰ期:此階段大概需要1 年時(shí)間,由20~80 例正常健康志愿者參加。這些試驗(yàn)研究了藥物的安全性方面,包括安全劑量范圍。此階段的研究同時(shí)確定了藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄、以及藥物的作用持續(xù)時(shí)間等項(xiàng)目。
臨床試驗(yàn),Ⅱ期:此階段需要約100 到300 名志愿患者參與進(jìn)行一些控制研究,以評價(jià)藥物的療效。這個(gè)階段大約需要2 年時(shí)間。
臨床研究,Ⅲ期:此階段持續(xù)約3 年時(shí)間,通常需要診所和醫(yī)院的1000~300 名患者參與。醫(yī)師通過對病患的監(jiān)測以確定療效和不良反應(yīng)。